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发布于 2024-08-05
如何制作葡聚糖凝胶柱?
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凝胶层析(gel chromatography)又称分子筛过滤、排阻层析。凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质,当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时,由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢,在缓冲液洗脱时,分子量大的物质不能进入凝胶孔内,在凝胶间几乎是垂直的向下运动,而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行,这样就可以按分子量的大小,先后流出凝胶柱,达到分离的目的。凝胶层析可用于脱盐、分离提纯、测定高分子物质的分子量、高分子溶液的浓缩等,具有设备简单,操作方便,分离迅速及不影响分子生物学活性等优点。
1. 溶胀
  取所需干胶,用5倍去离子水溶胀,2小时后待用。
  2. 装柱
  2.1 凝胶层析上样、平衡和洗脱只用一种低盐浓度的缓冲液;可选中性附近的Tris-盐酸、PBS缓冲液。
  2.2 将所取凝胶抽干,用初始缓冲液(按凝胶∶缓冲液=3∶1的比例)配成匀浆并脱气。
  2.3 将层析柱垂直固定,底端用水或缓冲液润湿并保持一段液位。
  2.4 用玻璃棒引导匀浆沿着柱内壁一次性倒入柱内,使凝胶在柱内自由沉降,水封层析柱,沉降过夜。
  2.5 连结好柱子顶端活动柱头,打开蠕动泵,让缓冲液用使用时操作流速流过5柱体积,再使用1.5倍的操作流速流过5柱体积,调节适配柱头,使其尽量贴近胶面,最后用2-3倍柱体积的缓冲液平衡柱子。
  注意:凝胶过滤介质的使用对装柱的要求较高,装柱效果可用丙酮-水溶液进行等板高度的检验。所有操作过程不能引入气泡,保证装胶的均匀度。
  3. 平衡
  将平衡缓冲液以操作流速平衡层析柱,观察检测器的变化,直到电导、pH等参数不变。
  4. 上样
  切换转换阀进行上样,上样量应尽可能减小;样品的预处理:除盐,平衡液配制,0.45mm微孔滤膜过滤。
  5. 洗脱
  用缓冲液洗脱,保持流速不变。
  6. 再生

作者:未知 来源:未知
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