2022年3月以来，狡猾的奥密克戎变异毒株又一次打破了人们平静的生活，全国各地陆续爆发新冠疫情，波及30个省（区、市）。  核酸检测作为新冠疫情精准防控的有效手段，俨然已成为一种生活常态，“今天你核酸了吗？  ”也转变为人们的日常问候语。  说到这，大家了解核酸检测中需要用到哪些核心原料吗？  本文就来介绍一下核酸检测中最关键的核心原料-酶。  

新冠核酸检测流程

酶是一类极为重要的生物催化剂，具有催化高效性和反应特异性。绝大多数生化反应均需要酶的参与，核酸检测也不例外。在新冠核酸检测过程中（图1所示），不同类型的分子酶在核酸检测的不同实验阶段（核酸提取、RT-qPCR）发挥了重要的作用。 接下来，根据核酸检测中的不同实验环节为大家梳理核酸检测过程中用到的核心酶原料。  

图1.新冠核酸检测流程

核酸提取过程中的核心酶

新冠病毒核酸提取过程主要包括裂解和纯化两大步骤： 

 裂解  是破坏样品细胞结构，从而使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程；  

纯化  则是使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离，反应过程需要蛋白酶K（Proteinase K）、脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase I）及RNase抑制剂的参与。

蛋白酶K

蛋白酶K是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，可切割脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键（图2所示）。在核酸提取过程中，蛋白酶K可降解与核酸紧密结合的组蛋白，促进核酸的分离，使样本核酸能更好的被提取。另外，蛋白酶K可降解RNA水解酶（RNase）活性，抑制RNase水解模板RNA。

图2.蛋白酶K水解肽键示意图

韵邦制药蛋白酶K来源于基因重组酵母菌株，比活性≥30 U/mg蛋白，不含RNase和DNase，在尿素和SDS溶液中酶活性稳定存在，在较广的pH范围内（pH 4.0~12.0）均有活性，适用于原位杂交样本制备，核酸纯化等实验中蛋白质的切割清除。  

脱氧核糖核酸酶Ⅰ

脱氧核糖核酸酶I（Deoxyribonuclease I, DNase I）可催化多种形式DNA，靶向切割邻近嘧啶的磷酸二酯键，产生5’端为磷酸基团、3’端为羟基的多聚核苷酸，平均消化产物最小为多聚四核苷酸。在新冠核酸提取过程中，DNase I主要用于除去RNA样本中的基因组污染，避免RNA模板中存在DNA残留，提高模板纯度。 韵邦DNase I来源于重组E. coli菌株，不含RNase，可以用于各种RNA样品的处理，最佳的工作pH范围是7-8。在Mg  2+  存在下，DNase I可随机剪切双链DNA的任意位点；而在Mn  2+  存在的条件下，DNase I可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端或有1-2个核苷酸突出的粘末端（图3所示）。

图3.DNase I在Mg2+以及Mn2+存在下可切割dsDNA原理图

RNase抑制剂

在新冠核酸检测过程中，样本核酸的提取、纯化或实验的反应体系配制的过程中，均有可能引入核糖核酸酶（RNase）的污染，导致RNA模板被降解。若要避免RNase的污染，则需要RNase 抑制剂（RNase Inhibitor）发挥作用。 RNase Inhibitor是人的胎盘中存在的一种特异性RNase抑制剂，能够特异地与RNase以非共价键结合形成复合体从而使RNase失活。韵邦鼠源RNase抑制剂Murine RNase Inhibitor（Cat#10603ES）不含人源蛋白中的两个对氧化非常敏感的半胱氨酸，具有更高的抗氧化活性，能够广泛抑制各种类型RNase(RNase A, B, C)，更加适合于对高二硫苏糖醇（DTT）敏感性的实验如qPCR反应。

RT-qPCR过程中的核心酶

在完成新冠样本核酸提取后，可通过RT-qPCR来完成核酸的检测。在这些实验过程中，DNA聚合酶、逆转录酶、尿嘧啶DNA糖基化酶都是必不可少的核心酶原料。

逆转录酶

提取纯化后新冠病毒RNA，在进行qPCR反应前需先通过逆转录酶催化dNTP聚合（即RT-Reverse Transcription，逆转录反应），生成与模板RNA互补的cDNA序列（图4）。对于RT-qPCR反应，应选择可耐高温的逆转录酶，目前市面上应用最广泛的为MMLV逆转录酶，因其缺乏DNA内切酶活性且RNase H活性较低，在cDNA克隆应用中更有优势。  

图4.逆转录过程示意图   

韵邦制药第五代耐热逆转录酶（Cat#11300ES）是通过基因工程技术得到的全新逆转录酶，热稳定性好，可耐受高达60℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录，可扩增长达10 kb的cDNA。

DNA聚合酶

完成模板逆转录过程生成双链cDNA以后，就需要PCR反应中的“灵魂选手”DNA聚合酶闪亮登场，通过聚合游离的脱氧核糖核苷酸进行DNA链的延伸，在体外完成模板DNA的大量扩增，实现病毒核酸可被检测的目的。 在RT-qPCR反应中常用的DNA聚合酶为热启动Taq DNA聚合酶，该类酶在常温条件下无活性，只有经过热启动以后才具有聚合活性，可以最大限度地减少背景信号的生成，很好的解决了常规PCR反应中引物二聚体产生或错配引起的非特异性扩增等问题。目前市面上常用的DNA聚合酶热启动修饰方法主要有化学修饰、配体修饰和抗体修饰等，不同的热启动修饰方法原理如图5所示。  

图5.不同类型修饰热启动酶原理图

韵邦制药High Specific Taq DNA Polymerase, 5 U/μL（Cat#10726ES）是双抗体进行双封闭的热启动DNA聚合酶，具有高模板亲和力。在常温下不仅封闭了5'→3'聚合酶活性，同时也封闭了5'→3'核酸外切酶活性。在95℃条件下变性30sec其封闭抗体即可完全失活，释放出DNA聚合酶活性和核酸外切酶活性。双封闭特性不仅能有效防止错配或引物二聚体引起的非特异性扩增，又能有效抑制探针降解产生的荧光信号下降，双重保障使体外检测试剂在运输或室温使用过程中更加稳定。

尿嘧啶DNA糖基化酶

在新冠核酸检测过程中，操作环境中的气溶胶污染是造成PCR结果假阳性最常见的因素，在扩增体系中加入UDG酶（Uracil DNA Glycosylase，尿嘧啶DNA糖基化酶）则可有效消除PCR体系中混入的扩增残留污染物（多以气溶胶形式存在），保证扩增结果的准确性。UDG酶防污染原理如图6所示。

图6.UDG酶防污染原理示意图